Instituição: PIBIC

Orientador (a): RENATO DE OLIVEIRA RESENDE

Resumo:

Introdução Em março de 2020 a Secretaria de Saúde do DF confirmou o primeiro caso do novo coronavírus (SARS-CoV-2) no Distrito Federal. Este estudo se propôs a investigar o vírus SARS-CoV-2, que, por ser um vírus de RNA, apresenta altas taxas de mutação e replicação, configurando no momento atual a existência de pelo menos 5 variantes (Alpha, Beta, Gamma, Delta e Kappa) de preocupação (VOC) segundo a OMS. Através do sequenciamento genômico, é possível acompanhar essas mudanças no genoma viral e monitorar a dinâmica de crescimento das VOC ao longo do tempo/espaço, sendo isso importante pois essas mutações ao se fixarem ou serem compartilhadas entre as diferentes VOC, podem representar maior vantagem evolutiva ao vírus e possivelmente agravar a epidemia. Dessa forma, foi feita a monitoração da diversidade genética dos vírus circulantes no DF através do sequenciamento de amostras em tempo real para posterior estudo da imunologia na interação vírus-hospedeiro.

Metodologia Extrações de RNA a partir de swab nasofaríngeos foram selecionadas em parceria com o Laboratório Central de Saúde Pública do DF, que foram testados positivos em RT-PCR e 24 amostras foram selecionadas para sequenciamento e montagem das bibliotecas. A partir desse RNA foi feito o cDNA e a partir dele, PCRs com os primers “Midnight” para amplicons de 1200 pb que visam amplificar o genoma completo do SARS-CoV-2. Os amplicons foram quantificados, ligados aos barcodes e preparados para sequenciamento com MinION Nanopore. As sequências foram analisadas no NextClade (v1.5.3) para avaliação da qualidade e no Pangolim (v3.1.7) para a classificação inicial das linhagens. Simultaneamente, os genomas foram alinhados com sequências de diferentes linhagens circulantes no Brasil e a dinâmica espacial e evolutiva foi estimada com auxílio do software Nextstrain SARS-CoV-2. As mutações foram reconstruídas ao longo da filogenia e o número de eventos independentes determinados para cada mutação.

Resultados Ao todo foram sequenciados 24 genomas, todos pertencentes à linhagem Gamma. Dois genomas apresentaram uma mutação não-sinônima no gene que codifica a proteína "spike" na posição P681H. Para determinar se esta mutação ocorreu de maneira independente ou se estes genomas fazem parte de uma linhagem circulante, estas sequências foram comparadas com outras sequências disponíveis em banco de dados público (GISAID). Foram comparadas 6.720 sequências e a análise dos resultados permitiu concluir que existem ao menos cinco clados na linhagem Gamma que possuem esta mutação. Estes clados estavam distribuídos em diferentes regiões do Brasil, EUA e Europa. As amostras do Distrito Federal agrupam-se no clado com amostras de diferentes regiões do Brasil.  Além disso, foi encontrado um clado com a mudança P681R, com seis sequências, todas do estado de São Paulo.

Discussão/Conclusão Mutações definidoras das VOC cujo impacto biológico já havia sido determinado e que não eram observadas em outras linhagens estão sendo detectadas em diferentes clusters e regiões do Brasil e do mundo. A mutação P681H encontrada em nossos resultados surgiu como definidora da variante Alpha, indicando um compartilhamento com a VOC Gamma, predominante no DF. A P681R, característica da VOC Delta, também começou a surgir em outras linhagens. Por ocorrer no gene S codificante da proteína Spike, essas mutações são de extrema importância, podendo influenciar na ligação e infecção de células hospedeiras. Assim, é possível que haja uma tendência de fixação dessa mutação convergente ao longo da evolução viral, sendo essencial dar continuidade nos estudos de vigilância genômica e investigar o seu impacto biológico, sendo esse o próximo passo do nosso projeto de pesquisa, pois estudos mostram que mutações como a P681R conferem capacidade de evasão à resposta imune.

Colaboradores: Fernando Lucas Melo, Aline Belmok, Anamélia Lorenzetti Bocca.