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Orientador/a: BERGMANN MORAIS RIBEIRO

Colaboradores: Fabrício da Silva Morgado

INTRODUÇÃO

Os baculovírus pertencem a um grupo amplo de vírus que infectam insetos das ordens Diptera, Hymenoptera e Lepidoptera. Caracterizam-se por possuírem genomas circulares de dsDNA, variando de 80-180 kpb, e por produzem dois fenótipos infectivos. Os baculovírus são utilizados como vetores para expressão de proteínas heterólogas e como biopesticidas. A supressão de respostas celulares antivirais pode ser explorada visando uma melhora na virulência e na expressão de proteínas. Trabalhos recentes sugerem que o gene NSs derivado do Tomato Spotted Wilt virus (TSWV) aumente a expressão gênica e replicação do baculovírus durante a infecção de células de inseto e  de larvas. O presente trabalho busca investigar o efeito da expressão precoce do supressor de silenciamento gênico NSs de TSWV na infecção baculoviral. Além disso, pretende-se investigar se a proteína NSs substitui a função da proteína baculoviral P35, conhecida como supressor apoptótico e da via de RNAi.

METODOLOGIA

Seis baculovírus recombinantes contendo diferentes genes heterólogos foram construídos usando o sistema Bac-to-Bac®. Esses vírus possuem: o gene NSs sob comando do promotor HSP70, o gene da poliedrina (polh) e o da proteína fluorescente verde (egfp) (Bac-HSP70NSs-PG), para avaliação de permissividade, o gene NSs e luciferase (fluc) (Bac-HSP70NSs-PHFLUC), sem o gene NSs e com fluc (Bac-?NSs-PHFLUC), para quantificação de expressão gênica, e mais três vírus recombinantes com as mesmas combinações de genes descritas acima, adicionadas da deleção do gene p35 (Bac-?p35-HSP70NSs-PG, Bac-?p35-HSP70NSs-PHFLUC, Bac-?p35-?NSs-PHFLUC). Os recombinantes foram usados para infectar células não permissivas, semipermissivas e permissivas, as quais foram verificadas por microscopia de luz e fluorescência para observação de apoptose e produção de EGFP. Além disso, as células infectadas com vírus contendo o gene luciferase foram submetidas a ensaio de luminescência em diferentes horas pós-inf

RESULTADOS

Os plasmídeos de transferência foram confirmados por PCR e sequenciamento Sanger. A expressão de NSs durante infecção celular foi confirmada por Western Blot. Por microscopia, notou-se que certas linhagens celulares de mosquitos não exibiam produção de EGFP e outras sim, porém sem efeitos citopáticos e sem produção de cristais de poliedrina. Em células permissivas, a ausência da proteína P35 resultou em apoptose mesmo na presença de NSs, já as células infectadas pelos vírus recombinantes contendo os dois genes não apresentaram apoptose ou apresentaram apoptose em momentos tardios da infecção. Com os testes de luminescência, observou-se que a proteína NSs reduziu a expressão de luciferase, o que não foi notado com a ausência de P35. A intensidade de expressão de luciferase em células permissivas pode ser posto em forma decrescente para os vírus: sem NSs e com p35, com NSs e sem P35, sem NSs e sem P35, com NSs e com P35, luminescência não foi detectada em células de mosquitos.

CONCLUSÃO

Os resultados indicam que, devido a indução apoptótica em vírus com NSs e sem p35, a proteína NSs não substitui a função anti-apoptótica da proteína P35. Entretanto, a NSs resgata a expressão de luciferase em células infectadas pelos vírus sem P35, o que sugere envolvimento da NSs em via de silenciamento gênico. A constatação de menor luminescência, em células infectadas com vírus contendo ambos os genes, propõe interferência entre as vias que ambas proteínas participam, o que resultou em um  efeito contrário ao esperado para a expressão de silenciadores gênicos. Tal fato pode ter como analogia, o descobrimento da via de RNAi, onde a superexpressão de genes leva a sua inibição. Não se sabe ainda por qual mecanismo ocorre essa interação e possível estimulação de defesa celular. Os próximos testes buscam elucidar mais a fundo esse sistema por quantificação de caspases e construção de hairpins para silenciamento de luciferase via RNAi